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细胞凋亡检测实验(Annexin V FITC/PI双染色法)

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发表于 2015-10-8 22:07:12 | 显示全部楼层 |阅读模式
细胞凋亡(apoptosis)与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用,它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
因此,有关凋亡的研究在临床和基础等各个领域已经广泛开展,凋亡细胞的检测方法显得非常重要。
细胞凋亡检测可以:(1)用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究;(2)应用于临床诊疗,新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治疗;(3)对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。
为此,斑竹君特意对一项最常用的Annexin V FITC/PI双染色法检测细胞凋亡的方法进行了归纳和总结,以避免各位再浪费更多的时间寻找啦。现完整奉上,请大家笑纳。不足之处,各位大虾可以补充,大家一起学习共同进步啦O(∩_∩)O ~。
一、实验原理
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。
Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。
PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
二、实验方法和步骤
1.     流式细胞分析操作方法:
1)       细胞收集:
对贴壁生长细胞,离心收取培养液内的悬浮细胞,并用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞(消化时间不宜过长,否则容易引起假阳性),合并两部分细胞悬液;对悬浮生长细胞,直接收集细胞。
2)       用冰冷PBS洗涤细胞后, 1000g离心5 min,弃上清,加入500uL的Binding Buffer轻轻重悬细胞。
3)       加入5uL Annexin V-FITC混匀后,加入5uL DAPI,轻轻混匀,避光,反应5-15min
4)       在1h内,进行流式细胞上机检测
流式细胞仪分析: FITC: Ex=488,Em=530nm; PI: Ex=488,Em=≥630
a. Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测,PI红色荧光(流式Ex=488,Em≥630)通过FL2或FL3检测,建议使用FL3。
b. 荧光补偿调节:使用经凋亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿去除光谱重叠和设定十字门的位置。
5)       结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。
2.     荧光显微照相操作方法:
1)     滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞;
2)     对于贴壁细胞来说,也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡;应同时设置阴性对照。
a.      将细胞于盖玻片上生长,用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并设立阴性对照组;
b.     用冰冷PBS洗涤细胞两次;
c.      在500μL的BindingBuffer中加入2μL Annexin V-FITC,5 μLPI,混匀;
d.     将上述溶液滴加于盖玻片表面,使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖;
e.      避光、室温反应5 min。
3)     将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下、双色滤光片(FITC和Rhodamine)观察AnnexinV- FITC荧光信号呈绿色,PI荧光信号呈红色
4)     结果判断:结合Annexin V-FITC的凋亡细胞的质膜将显示绿色光圈;膜结构不完整的坏死细胞和晚期凋亡细胞在整个核区被PI染成红色而质膜为AnnexinV-FITC阳性呈现为绿色光圈。


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发表于 2015-12-22 20:20:27 | 显示全部楼层
请问我们的结果很低,除了阴性,其他加起来还不到2%,这样的结果可以证明是有促凋亡的作用吗?

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 楼主| 发表于 2015-12-27 14:50:21 | 显示全部楼层
陈志从 发表于 2015-12-22 20:20
请问我们的结果很低,除了阴性,其他加起来还不到2%,这样的结果可以证明是有促凋亡的作用吗?

这样的结果,证明不了有促凋亡的作用。如果是药物作用时间太短则可以增加培养时间,如果是药物浓度太低则可以增加药物浓度

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发表于 2016-1-9 14:24:15 | 显示全部楼层
最近正要做这个~谢谢楼主

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发表于 2016-2-15 18:20:47 | 显示全部楼层
步骤很详细,学习了
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