查看: 335|回复: 0

稳定转染后的HEK293细胞能扩大培养吗?扩大培养后基因会不会丢失?

[复制链接]

71

主题

77

帖子

731

积分

管理员

Rank: 9Rank: 9Rank: 9

积分
731
发表于 2017-8-22 15:30:05 | 显示全部楼层 |阅读模式
1、我刚进实验室,正准备用HEK293转染,请问稳定转染后的HEK293细胞能扩大培养吗?扩大培养后基因会不会丢失?我在文献上看到HEK293转染有脂质法、磷酸钙沉淀法,FUgene6法,请问哪种方法更好?
答:稳定转染的细胞可以使用很久的,建议获得稳定株后冻存一段时间再用,可能效果会好点,转染什么的没多大区别,对293来说,脂质体就挺好的!

2、我在培养细胞(Huh-7)过程中发现培养液内有很小的杆状物,黑色,高倍镜下仔细观察会发现其有轻微的游动;培养液清,不应该是细菌或真菌污染;有人称其为"黑焦虫",另外,冻存的细胞复苏后仍有,这到底是什么?
答:一般不会是支原体污染,支原体污染的话,高倍镜下不应该看到明显游动的杆状物的;也有可能污染了黑胶虫之类的。
推荐处理方法:
停止复苏,停止养细胞,彻底消毒所有用于细胞培养的一切用品,包括所用的培养瓶,培养基,吸管,胰酶,孵箱,超净台、空间等等你能想到的和细胞培养相关的所有物品,包括你的白大褂。一个星期后,再复苏污染之前冻存的细胞。这样可能工程量有点大,但可以用一个星期的时间挽救两个月的时间,还有其他你为了找到污染源,去除污染所耗费的精力和财力。

3、树突状细胞(DC细胞)应该怎么进行收集,有具体的实验方法吗?成熟DC贴壁牢吗?
答:来源有外周血、骨髓、脐带等分离出单个核细胞,加入完全培养基贴壁法2-4小时,把悬浮细胞移出,剩下贴壁的细胞加入含特定诱导因子的培养基,经过一周左右,可以培养出DC细胞;还有使用磁珠分选法把这部分细胞与淋巴细胞分开后然后经过加入特定因子培养出DC细胞。

DC前体细胞主要负责免疫递呈,变形能力和吸附能力是行驶该功能的关键。因其细胞的强大变形能力和细胞表面丰富的蛋白、糖蛋白,所以极易吸附。

4、在培养平滑肌细胞中,出现了很多的成纤维细胞,请问有什么好的办法可以分离出它们?
答:1、差速贴壁法:成纤维细胞贴壁快,平滑肌细胞贴壁慢。
2、加入5-溴-2′-脱氧尿苷(5-Brdu),终浓度为0.1 mM,抑制成纤维细胞生长。
(以上方法仅供参考,详细还需根据个人的试验情况而定噢!)

5、我养的是大鼠卵巢颗粒细胞,方法是将卵巢表面的卵泡刺破,释放出颗粒细胞,但培养的细胞总是圆圆的,并不像文献上说得变成多角形,且24小时换液后,加入处理因素(含药大鼠血清)后,细胞的生长情况就很差,背景中有许多小黑点,该怎么解决?
答:黑点可能为血清中一种黑胶虫。另外,可能是药物导致细胞生长状况不佳,待细胞状况稳定以后加药。
建议用Hank's液洗细胞,离心2000rpm 10',每次洗可筛除不好的细胞。留下健康细胞。稳定2周后,可做药物处理。

6、我的师兄一般在离心之前加入血清来终止消化(此时需血清量大)。请问有这个必要吗?如果没有必要,是不是很浪费血清?
答:请问您的师兄是不是用胰酶和EDTA消化呢?胰酶+EDTA消化后,需要用含血清的培养液终止的,但量不会很大。1~2ml的0.25%的胰酶用4~5ml的含10%胎牛血清的M199培养液即可终止,离心是必须的,因为EDTA会影响细胞贴壁。
我比较喜欢使用corning的Cellstripper或者Accutase,作用更温和,对细胞影响小,消化时间更易控制,无需使用蛋白或血清终止。

7、很多细胞实验在种板之前都需要细胞计数,理论上消化成单细胞悬液最好。但是对于一些细胞,比如HEPG2,很容易成片的生长,每次消化也很难达到所谓的单细胞悬液状态,有什么比较好的解决方法吗?
答:其实并不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了,一般你肉眼观察贴壁细胞层,只要能移动了,多半呈沙壮移动,其实已经可以了,很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞,这是没有必要的。

一般能移动了,说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了,细胞之间的附着也已经消失了,细胞已经独立分布了(虽然没有呈现很广的离散分布)。这个时候应该停止消化,不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好,间隙很大,才停止。

细胞就是完全成单个细胞悬液,之后在贴壁的过程中仍然会聚集,这个是贴壁培养的细胞,尤其是肿瘤细胞的一个特性,无论死活的细胞都是如此,你可以尝试,准备100%的单个细胞悬液,贴壁后观察细胞,仍然是几个几个细胞聚集在一起。一些悬浮培养细胞也是如此,容易聚集,不要去尝试过几个小时就拿出来吹打成单细胞悬液。细胞只要能从基质上脱离下来,这个时候即使是成片的(比如Calu-3细胞),吹打不超过20次后(一般10次即可),成小规模聚集(10个细胞左右),是正常的,不要试图再去延长消化时间,或者象有的同学那样吹打1h,等待单细胞悬液出现。

但有些细胞消化方法正确,仍然成片分布,甚至完全吹打成单细胞悬液,贴壁后仍然成片分布,这是细胞的特性,是因为贴壁过程中重新聚集了。这个时候你拼了命要去让它均匀分布,你的细胞之后会对你越来越不好。


本帖子中包含更多资源

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?立即注册

x
您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

快速回复 返回顶部 返回列表