查看: 408|回复: 0

抑制干细胞分化的饲养层细胞(MEF)该如何进行冻存?

[复制链接]

75

主题

81

帖子

765

积分

管理员

Rank: 9Rank: 9Rank: 9

积分
765
发表于 2017-9-11 14:29:02 | 显示全部楼层 |阅读模式
1抑制干细胞分化的饲养层细胞(MEF)该如何进行冻存?
-------------------------------------------
饲养层细胞指的是一些特定细胞(如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞),经有丝分裂阻断剂(常用丝裂霉素)处理后所得的细胞单层。现在一般用于干细胞培养,以抑制干细胞分化和促进干细胞增殖。该如何对其进行冻存?
1. 吸去培养液,加3ml0.25%胰酶至完全覆盖瓶底(以T75为例)。
2. CO2培养箱中孵育3-5分钟,不时轻拍瓶壁,使细胞层脱落。
3. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶,吹打混匀。
4. 将其转移至15ml离心管,用电子计数器进行计数后,以1000rpm的速度离心5分钟。
5. 移去上清,用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。
6. 缓慢加入等量的MEF细胞冻存液(2x)并混匀。
7. 分装上述细胞悬液于2ml冻存管中,每管0.25ml。
8. 在冻存管上注明细胞名称,代数,数目,冻存时间。
9. 将冻存管放到冻存盒中,-80℃冰箱过夜。
10. 最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。

2如何进行无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代?
-------------------------------------------
人胚胎干细胞(hES)在医学界中具有重要的基础研究价值和巨大的临床应用前景。目前,大部分胚胎干细胞培养都使用饲养层细胞,但这个方法制备繁琐,因此以无饲养层培养体系替代饲养层培养体系,是近年来hES细胞基础研究的重点和热点。如何进行无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代?
1. 在培养瓶中加入适量matrigel(覆盖瓶底即可)放入培养箱孵育 1小时左右。
2. 吸去 matrigel,将饲养层培养的人胚胎干细胞传代洗涤后,最后细胞转移到此培养瓶中,加CM培养。
3. 在人胚胎干细胞克隆生长5天左右传代。吸去培养液,加 dispase 5%CO培养箱2消化至克隆大部分脱壁。
4. 加适量培养液,用移液管轻轻吹打使克隆脱壁。
5. 将细胞悬液转移到15ml离心管中,用移液管吹打几次使细胞克隆至适当大小。
6. 吸取适量混匀的悬液至小离心管中,离心沉淀,用胰酶消化成单细胞,加培养液中和,细胞计数。
7. 以1000rpm的速度离心5分钟。
8. 吸去上清,加CM培养液重悬细胞。
9. 按照_90,000–170,000 cells/cm2将细胞接种到已铺好matrigel的培养瓶中,补加适量CM。轻轻晃动培养瓶,使克隆均匀分布在瓶底,放入5%CO培养箱2培养。
虽然无饲养层培养体系比饲养层培养体系更具优势,但是大多数hES细胞无饲养层培养体系中仍含有动物源蛋白或人源性蛋白,而且在限定性培养基中添加的各种生长因子非常昂贵。所以这个方法还有待改进。

3如何进行人表皮黑素细胞的原代培养?
-------------------------------------------
黑素细胞(melanocyte,MC),又称黑色素细胞,主要位于表皮的基底层,与表皮细胞共同组成表皮黑素单位。黑素细胞中的黑色素能吸收大部分紫外线,从而保护和减轻由日光引起的皮肤损伤,是防止紫外线透入真皮的重要屏障。
操作方法:
1、 取新生儿或青少年(最好在10岁左右或以内)包皮环切术后包皮组织,为保证无菌,处理前在75%乙醇中浸泡1min;
2、 将包皮组织转入培养皿中,用加入抗生素的PBS清洗,用眼科剪和眼科镊修剪,尽量去除皮下组织,用锋利11号手术刀片将组织分切为2mm×10mm;
3、 取4块组织放入15ml离心管中,加入4ml皮肤分离液(1ml/块皮肤),37℃,2.5h;如果用冷消化(推荐使用),则用PBS将上述分离液稀释一半,加入4ml(1ml/块皮肤),4℃,消化过夜(约15h);
4、 将消化后的皮肤倒入培养皿中,用眼科镊(一直一弯)将表皮和真皮仔细分离(必须极为小心,避免把真皮组织带入表皮组织中);
5、 将分离的表皮放入离心管中,加入4ml细胞分离液,37℃,消化10min;用含血清的培养液终止消化,用吸管反复吹打以获得单细胞悬液,过筛网以去除剩余残渣,收集滤液,离心去除消化液,用PBS清洗两次,加入MC培养液(黑色素细胞);
注意:尽量避免真皮细胞对MC的污染,因为MC培养液对成纤维细胞无抑制作用,而正确严格的操作可以减小污染的机会;如果较多成纤维细胞的生长,可用含200μg/ml遗传霉素的黑素细胞培养液处理2—3d,以抑制成纤维细胞的生长。

4以Hela细胞为例给出的可获细胞量为例子,常用的细胞培养板有哪些,如何选择?
-------------------------------------------
细胞培养板作为培养细胞的一种常用和重要的工具,形状、规格、用途多样,你是否为如何选择适合的培养板而迷茫?以Hela细胞为例给出的可获细胞量为例子,常用的细胞培养板有哪些,如何选择?注意:各种单层生长的细胞在培养板中长满的细胞数,主要取决于器皿底表面积和细胞体积的大小。用一个表格作为说明:
培养器皿
底面积(cm2)
加培养液量(mL)
可获细胞量
96孔培养板
0.32
0.1
105
24孔培养板
2
1.0
5×105
12孔培养板
4.5
2.0
106
6孔培养板
9.6
2.5
2.5×106
4孔培养板
28
5.0
7×106


5如何选择适合您的神经干细胞的培养基?
-------------------------------------------
神经干细胞(NSC)是未分化的前体细胞,特点是能够自我更新,并具有多潜能性。通过增殖和分裂,神经干细胞产生克隆相关的后代,它们分化形成中枢神经系统中所有主要的细胞类型。其中包括神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和衬在脑室上的室管膜细胞。
说到神经干细胞的培养,大家肯定首先想到Neurobasal培养基、B-27、N-2等。当然,现在也有一些无血清的培养基,比如Life Tech的StemPro® NSC SFM。它能对来自胚胎干细胞或胚胎组织的神经干细胞进行良好扩增,支持贴壁培养物和神经球体悬浮培养物的长期生长和扩增。在StemPro® NSC SFM中生长的神经干细胞保持着分化为生理活性神经元和胶质细胞的潜能。

6原代神经元培养的时候,该如何选择培养基?
-------------------------------------------
建议不要使用血清培养基。因为:其一,血清刺激胶质细胞和杂细胞分裂,最后非常影响神经元产量;其二,为了抑制胶质生长,往往要加入阿糖孢苷。严重的毒性会影响许多灵敏实验;最后,也是最重要的一点,即血清培养的细胞状态很不均一,从正常到凋亡都有,严重影响试验准确,而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态,要么都好,要么都差,高度一致。

Life旗下的Gibco 无血清培养基neurobasal(neurbasal-A)被认为是最标准,最好的培养基。需要的添加剂为 B27和谷氨酰胺。培养出的细胞状态均一,胶质细胞几乎不分裂。其中,neurobasal是胎鼠培养基,而-A为新生鼠培养基。(注意:不要中途换培养基,要从一而终。)

很多实验室是不加抗生素的,也有的实验室加。由于很多初学者操作不熟练,不注意,很多人会污染,所以建议加双抗。(注意:由于无血清培养基添加剂不是血清,而是人工合成的B27,血清有复杂的解毒作用而B27没有,双抗对细胞的干扰,无血清培养基要大的多。所以,如果你在neurobasal里添加抗生素,那么用量只要标准量的一半。)

另一个添加成分谷氨酰胺溶液不稳定,所以每次用时候要现配现加。根据相关文献进行配制。

7冷冻细胞的最佳密度取决于什么?
-------------------------------------------
冷冻细胞的最佳密度通常取决于细胞类型。哺乳动物细胞的冷冻密度通常1×106到1×107。低温冷藏培养基与贴壁和悬浮细胞培养基不同。

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

快速回复 返回顶部 返回列表