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细胞转染之实验小贴士

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发表于 2017-9-11 14:32:10 | 显示全部楼层 |阅读模式
细胞转染目前已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。本文整理了一些关于转染实验前的准备工作及一些实验过程中的小贴士,希望这些信息能够帮助各位科研君们做好转染实验及提高实验效率。
① 从健康细胞开始
Ⅰ 转染实验前,细胞解冻后传代3–4次。 这使得细胞从解冻过程中恢复过来,并恢复正常的生长速度。
Ⅱ 仅使用活性 >90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。
Ⅲ 定期传代细胞,切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。如果让细胞长到汇合状态,可能会改变细胞的生长速度以及形态。
a. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper™试剂(Corning 25-056-CI)使细胞脱壁。Cellstripper™试剂可于室温下存储在通风橱中。可通过添加过量的Cellstripper™来跳过PBS洗涤的步骤,然后吸弃全部液体,仅留可覆盖瓶子表面的液体。
* 非酶类细胞分离溶液,其配方是螯合剂的专利配方,可温和分离组织培养物的贴壁细胞。性质比胰酶更温和。
b. 传代条件取决于所用的细胞系。 部分经验法则:
对于快速生长的细胞,倍增时间为16小时(如HEK-293),按1:10的比例分瓶。
对于生长缓慢的细胞,倍增时间为36小时(如原代细胞),按1:5的比例分瓶。
Ⅳ 保留冻存的细胞系,并定期解冻新细胞。 传代次数高(>30–40)时,细胞的生长速度和形态会改变。

② 进行实验之前,请先规划您的实验。
务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量,并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。
Ⅰ 开始前,设计好铺板路线图,标注好每次处理或实验条件。
Ⅱ 计算所需脂质体和DNA的储备量,并确认有足够的下列材料:TransfectGRO减血清培养基(Corning 40-300-CVR),Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX试剂,以及DNA (0.5–1 μg/μL)。

③ 转染时,请使用优质DNA。
Ⅰ 使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。
Ⅱ 通过测量OD 260/280值来确定DNA纯度,测得的OD值应介于1.7–1.9]之间。数值过高或过低均说明有杂质,不宜用于转染实验。
Ⅲ 在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。
Ⅳ 制备的工作浓度为0.5–1 μg/μL。 可用SpeedVac®浓缩仪或透析过滤装置(例如,Millipore Amicon®超滤管)来浓缩DNA。

④ 转染当天,将细胞铺板。
Ⅰ 如果在转染前一天或更早时间铺板,转染效率可能下降。
Ⅱ 转染时,细胞密度保持在汇合率为70–90%。
Ⅲ 转染时,细胞密度影响转染效率。 为了简化转染优化过程或节省时间,我们建议细胞铺成2种不同的密度,以确保较高的转染效率。
Ⅳ 细胞的铺板和转染可同时进行,或者通过反向转染操作进行。 反向转染操作中,使用的细胞是正常/正向转染的2.5倍以上。
Ⅴ 转染复合物可以加到含抗生素和血清的培养基中,且不会影响转染效率。

⑤ 准备脂质体-DNA复合物。
Ⅰ 为了获得最佳的试验结果,我们建议在TransfectGRO培养基中混合脂质体和DNA。 另一种方法是使用无血清培养基。
Ⅱ 在TransfectGRO培养基中稀释脂质体。 在第二管Opti-MEM®培养基中稀释DNA,然后和等体积脂质体溶液混合。 该2步稀释法可获得更优质的数据,比脂质体直接加入稀释的DNA中的方法获得的结果更有重复性。
Ⅲ 脂质体一旦在TransfectGRO培养基中稀释,在加入稀释的DNA之前,最佳孵育时间为2- 5分钟。 稀释的脂质体孵育时间不要超过20]分钟。
Ⅳ DNA的TransfectGRO溶液更加稳定,最早可以提前4小时制备,但不要太早。
Ⅴ 等体积稀释的脂质体和DNA溶液等体积混在一起后,通过缓慢地上下吹打来混合溶液,也可轻弹试管底部,或者快速涡旋混合。
Ⅵ 脂质体/DNA复合物温育5-10小时后,将复合物转移到含有细胞和生长培养基的孔中。 将复合物滴加到培养基上,然后轻轻地晃动板子。 切勿剧烈地将孔中的脂质体/DNA复合物分散,否则会使细胞移位。

⑥ 利用含GFP或LacZ之类报告基因的质粒作为阳性对照,评估转染效率。
利用显微镜(例如FLoid™细胞成像工作站)或流式细胞仪(例如Attune®声波聚焦流式细胞仪)可轻松测定转染细胞和GFP蛋白表达细胞的百分比。 可使用ToxBLAzer™试剂盒来测定LacZ基因的表达。
Ⅰ 转染后24-48小时,应该可以看到或检测到质粒的表达。
Ⅱ 阳性对照可以放在一个单独的孔中,或是与感兴趣的质粒共转染。 共转染过程中,在加入稀释的脂质体之前,可在TransfectGRO培养基中将50–100ng带GFP的质粒和100 ng感兴趣的质粒混合。

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